10mL(×2);胶头滴管(×2)

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小编:实验:蛋白质两性性质及等电点的测定 目的要求 (1)了解蛋白质的两性性质。 (2)掌握通过聚沉测定蛋白质等电点的方法。 实验原理 蛋白质是两性电解质。蛋白质分子中可以解离的

  实验:蛋白质两性性质及等电点的测定 目的要求 (1)了解蛋白质的两性性质。 (2)掌握通过聚沉测定蛋白质等电点的方法。 实验原理 蛋白质是两性电解质。蛋白质分子中可以解离的基团除N端α―氨基与C端α―羧基外,还有肽链上某些氨基酸残基的侧链基团,如酚基、巯基、胍基、咪唑基等基团,它们都能解离为带电基团。因此,在蛋白质溶液中存在着下列平衡: 阳离子两性离子阴离子 pH pIpH = pIpH pI 电场中:移向阴极不移动移向阳极调节溶液的pH使蛋白质分子的酸性解离与碱性解离相等,即所带正负电荷相等,净电荷为零,此时溶液的pH值称为蛋白质的等电点。在等电点时,蛋白质溶解度最小,溶液的混浊度最大,配制不同pH的缓冲液,观察蛋白质在这些缓冲液中的溶解情况即可确定蛋白质的等电点。 试剂和器材 一、试剂 1mol/L乙酸:吸取99.5%乙酸(比重1.05)2.875mL,加水至50mL。 0.1mol/L乙酸:吸取1mol/L乙酸5mL,加水至50mL。 0.01mol/L乙酸:吸取0.1mol/L乙酸5mL,加水至50mL。 0.2mol/L NaOH:称取NaOH2.000g,加水至50mL,配成1mol/L NaOH。然后量取1mol/L NaOH 10mL,加水至50mL, 配成0.2mol/L NaOH。 0.2mol/L HCl:吸取37.2%(比重1.19)HCl 4.17mL,加水至50mL,配成1mol/L HCl。然后吸取1mol/L HCl 10mL,加水至50mL,配成0.2mol/L HCl。 0.01%溴甲酚绿指示剂:称取溴甲酚绿0.005g,加0.29mL 1mol/L NaOH,然后加水至50mL。 二、测试样品 0.5%酪蛋白溶液:称取酪蛋白(干酪素)0.25g放入50mL容量瓶中,加入约20mL水,再准确加入1mol/L NaOH 5mL,当酪蛋白溶解后,准确加入1mol/L乙酸5mL,最后加水稀释定容至50mL,充分摇匀。 三、器材 试管1.5×15cm(×8);移液管1mL(×4),2mL(×4),10mL(×2);胶头滴管(×2)。 操作方法 一、蛋白质的两性反应 (1)取一支试管,加0.5%酪蛋白1mL,再加溴甲酚绿指示剂4滴,摇匀。此时溶液呈蓝色,无沉淀生成。 (2)用胶头滴管慢慢加入0.2mol/L HCl,边加边摇知道有大量的沉淀生成。此时溶液的pH值接近酪蛋白的等电点。观察溶液颜色的变化。 (3)继续滴加0.2mol/L HCl,沉淀会逐渐减少以至消失。观察此时溶液颜色的变化。 (4)滴加0.2mol/L NaOH 进行中和,沉淀又出现。继续滴加0.2mol/L NaOH,沉淀又逐渐消失。观察溶液颜色的变化。 二、酪蛋白等电点的测定 (1)取同样规格的试管7支,按下表精确地加入下列试剂: 试剂(mL) 管号 1 2 3 4 5 6 7 1.0mol/L 乙酸 1.6 0.8 0 0 0 0 0 0.1mol/L 乙酸 0 0 4 1 0 0 0 0.01mol/L 乙酸 0 0 0 0 2.5 1.25 0.62 H2O 2.4 3.2 0 3 1.5 2.75 3.38 溶液的pH 3.5 3.8 4.1 4.7 5.3 5.6 5.9 混浊度 (2)充分摇匀,然后向以上各试管依次加入0.5%酪蛋白1mL,边加边摇,摇匀后静置5min,观察各管的混浊度。 (3)用-、+、++、+++等符号表示各管的混浊度。根据混浊度判断酪蛋白的等电点。最混浊的一管的pH值即为酪蛋白的等电点。 注意事项 在测定等电点的实验中,要求各种试剂的浓度和加入量相当准确。 参考资料:

  蛋白质分子中含有多个可解离的酸性或碱性基团 (酸性基团主要是C末端羧基及酸性氨基酸侧链的羧基,碱 性基团有N末端的氨基及碱性氨基酸侧链的氨基、胍基及咪基)。 原理: 蛋白质由氨基酸组成。蛋白质分子除两端游离的氨基和羧基可解离外,其侧链上的某些酸性基团或碱性基团,在一定的溶液pH条件下,都可解离成带负电荷或带正电荷的基团。因此,蛋白质具有两性解离性质。当蛋白质溶液处于某一pH时,蛋白质解离成阳离子和阴离子的趋势相等,既净电荷为零,成为兼性离子,此时溶液的pH称为蛋白质的等电点(isoelectric point,pI)。蛋白质在等电点状态时溶解度最低,容易沉淀析出。蛋白质在大于其等电点的pH值溶液中带负电荷;在小于其等电点的pH值溶液中则带正电荷。蛋白质在等点电以外的PH值溶液中,因分子带有同种电荷而相互排斥,不易沉淀。本实验通过观察酪蛋白在不同pH溶液中的溶解度来测定其等电点。 蛋白质解离成阳离子 蛋白质成兼性离子 蛋白质解离成阴离子

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